测序原理
DNA测序技术主要依据Sanger的双脱氧链终止法。
以DNA单链为模板，在特定条件下，用特异的引物在测序级DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则，不断将4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)加到引物的3'-羟基末端并使引物链得到延伸。
这种链的延伸是通过引物的3'-羟基和脱氧核糖核苷酸底物的5'-磷酸基团形成磷酸二酯键来完成的。如果这种反应体系中加入双脱氧核糖核苷酸(ddNTP)，这种2'3'ddNTP的5'-磷酸基团是正常的，而3'位置缺少羟基，因此在DNA聚合酶作用下，仍然可以通过5'-磷酸基团与引物链的3'-羟基反应掺入到引物链中，但是由于ddNTP没有3'-羟基，不能继续与下一个5'-磷酸基团形成磷酸二酯键而导致引物链延伸的终止。这样，在测序反应体系中，DNA引物链不断合成与偶然终止，产生一系列的长短不等的核苷酸链。然后将这些测序反应产物进行电泳。
依据发色基团掺入方式的不同，可将其细分为：
引物标记法：将荧光素标记在测序反应所用引物的5’端
末端标记法：将荧光素标记在作为终止物的ddNTP上
技术优势
单向测序长度保证700－900bp。
特有全球领先的红外长程测序技术，使您的长序列测定不再烦恼，短序列准确度更高。1.5kb序列，双向反应，一次读通，免去引物合成。 99% 以上的准确率，可独家提供真实电泳影象，方便校对及发表论文。
独有Simultaneous Bi-directional Sequencing技术，实现同时双向测序，准确高效。
注意事项
测序引物暂限T7pro,T7ter,T3,SP6,M13F,M13R，PGEX-3'/5'。大量测序或有其他特殊要求，请来电垂询。
如果提供的是质粒，质粒量：
载体加上插入片段小于5kb，浓度不低于100ng/μl, 体积10μl。
载体加上插入片段约5 -10 kb 浓度不低于200ng/μl,体积10μl。
载体加上插入片段大于10 kb 浓度不低于250ng/μl,体积10μl。
如果客户提供菌液，需单菌落过夜培养菌液5ml。还需注明菌株名称，抗生素类型，质粒在菌内的拷贝类型，以及有无其它特殊培养要求（如温度、培养基等）。
如果提供菌液：请用灭菌的1.5ml离心管装1管过夜培养的细菌，保存时间请在三天内（4°C）。
如果提供经酚氯仿抽提的质粒，请寄样品时尽量多一些，质粒总量不少于10μg。
测序结果报告
收样后四个工作日内报告结果(见价目表)，外地客户以报告寄出日期为准。
每次正常单向反应读取有效序列在700bp-900bp。
提供的结果包括：
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请来电垂询
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问题与解答
1． 如何提供样品？
您可以提供0.5-1ml新鲜菌液，放进1.5ml离心管内，用封口膜封口以免泄漏。另外，客户也可提供穿刺菌。
2．为何推荐客户送菌液或菌株？
由于长程测序对于模板质量的要求相对要高些，所以我们全面采用著名的Qiagen Kit进行纯化操作。因此，强烈推荐客户直接寄送菌液或菌株，对于客户已抽提的质粒样品我们将视其质量而决定是否进行测序反应。
3．为什么没有PCR产物直接测序业务？
我们采用引物标记法，测序引物上必须有红外发色基团的修饰，因此客户未标记的引物就不能用此方法测序。当然这种情况下，我们还可以采用末端标记法进行测序，但其成本稍高，故一般不作考虑，如果确有大量此类样品，请来电垂询。
4．公司现有的红外标记测序引物有哪几种？
我们现有红外荧光标记的引物有：M13foward、M13reverse、T7promoter、T7terminator、T3promoter、SP6promoter、PGEX-5’和PGEX-3’，共计8种
5． 超过6Kb的DNA片断如何进行测序？
超过6Kb的DNA片段用亚克隆的方法，装入载体中，进行测序。详情可参照相关书籍。
关于结果
提问：测序报告包含哪些文件？
回答：提供报告的形式：
(1)测序报告通常为一份700-900bp的彩色图谱
(2)在提供书面报告的同时会提供一张软盘，里面包括对应的序列文本文件，并应客户要求提供图谱文件,Chromas软件和真实电泳图谱。
提问：为什么在测序报告上找不到扩增引物序列？
回答：原因可能是您在构建质粒时采用的工具酶的酶切位点距离您的测序引物太近，由于荧光染料的干扰在序列开始的部分不会十分准确。还有一种可能是您的插入片段的插入方向是反的，这时您不妨找一下您引物的互补序列。
提问：为什么测序引物3'端以后有几十个base无法读到？
回答：全自动荧光测序方法由于使用标记了红外荧光染料的引物，一些未反应完的引物会连同测序反应产物一并进行电泳，走胶时会干扰最初几十个碱基的信号，导致这部分碱基无法读清。一般的我们会在分析结果时切掉这部分无意义的数据。通常这也是载体的序列。所以选取测序引物时要使引物3'端离开要求测序的起始位置30bp以上比较合适。
提问：我觉得你给我的结果完全不是我需要的序列！
回答：出现这样的情况只有两种可能：
一、我们给您的测序结果对应的不是您的样品；
二、您的样品插入部分与您预期的不一致。作为提供测序服务的一方，我们无法判断测得的序列是否与您预期的结果一致，我们可以为您做的是，检查发送给您的测序结果与您提供来的样品是否一致。出现您这样的问题，我们常规的做法是进行验证实验。
验证实验的方法是取您的原始菌液重新抽提质粒进行测序。验证实验如在可靠范围内结果与前次不同则说明我们前次的测序结果是有问题的，前次测序的费用免除；如结果仍然相同，那么说明前次测序的结果准确，则您还需要支付这一次测序的费用。
提问：测序结果很不好，为何还要照常收费
回答：由于DNA结构上的原因，有时会出现反应中途无法进行之情况。如：GC rich; G、C cluster；Poly(A)、Poly(T)的连续结构等。此外，另一种情况为反应中途出现的套峰现象。此种情况一般为DNA结构中的重复序列，造成测序用引物和模板之间有二个以上的结合点。
以上为由于DNA结构原因造成了无法正常进行DNA测序，对这种情况，我们须按照正常反应收费。出现以上情况后，我们提倡从另一方向进行测序。
当然如果由于DNA本身或引物等原因，测序反应从开始就无法进行，此时按反应失败计算。 |
